1. As células a serem criopreservadas devem estar em bom estado de crescimento (fase log) e alta taxa de sobrevivência, com densidade de cerca de 80-90%.
2. Verifique se as células ainda mantêm suas propriedades únicas antes de congelar.
Por exemplo, o hibridoma deve ser testado quanto à produção de anticorpos um a dois dias antes da criopreservação.
3. Preste atenção à qualidade do crioprotetor.
O DMSO deve ser de grau reagente, estéril e incolor (filtrado com 0,22 mícron FGLP Telflon ou produtos estéreis adquiridos diretamente, como Sigma D-2650), aliquotados em pequenos volumes de 5-10 ml, armazenados a 4 oC no escuro. Não descongele várias vezes. O glicerol também deve ser de grau reagente e armazenado no escuro após a autoclavagem. Use dentro de um ano após a abertura, porque será tóxico para as células após armazenamento a longo prazo.
4. Concentração celular para criopreservação:
(1) Fibroblasto humano normal: 1~3 x 106 células/ml
(2) Hibridoma: 1 ~ 3 x 106 células/ml, a concentração de células não deve ser muito alta, alguns hibridomas morrerão após descongelar 24 horas devido à alta concentração de congelamento.
(3) Linhas tumorais aderentes: 5~7 x 106, dependendo do tipo de célula. O adenocarcinoma requer uma concentração mais alta após o descongelamento, enquanto o HeLa precisa apenas de 1-3 x 106 células/ml.
(4) outras suspensões: 5~10 x 106 células/ml, linfócito humano deve ter pelo menos 5 x 106 células/ml.
5. A concentração do crioprotetor é de 5 ou 10% de DMSO. Se as condições de congelamento das células forem incertas, uma cultura de backup deve ser usada durante a criopreservação para evitar falhas no congelamento.
6. Método de congelamento:
(1) Método tradicional: 4 oC 10 minutos ---> -20 oC 30 minutos ---> -80 oC 16-18 horas (ou durante a noite) ---> Armazenamento a longo prazo na fase de vapor do tanque de nitrogênio líquido .
(2) Programa de resfriamento: Use uma máquina de resfriamento de velocidade constante para reduzir da temperatura ambiente para –120 oC a uma taxa de –1 ~ -3 oC/min, e armazene-o na fase de vapor de um tanque de nitrogênio líquido por longos armazenamento a prazo. É adequado para a preservação de células em suspensão e hibridomas.
7. Materiais:
(1) Células cultivadas que crescem bem
(2) Meio fresco
(3) DMSO (Sigma D-2650)
(4) Tubo de criopreservação de plástico estéril (Nalgene 5000-0020)
(5) 0,4% p/v azul de tripano (GibcoBRL 15250-061)
(6) Placa de hemocitômetro e vidro de cobertura
(7) Máquina de resfriamento de velocidade constante (KRYO 10 Series II)
8. Etapas:
(1) Troque metade ou a quantidade total do meio um dia antes do congelamento e observe o crescimento celular.
(2) Preparação da solução de criopreservação (preparação antes do uso): Adicionar DMSO ao meio fresco, a concentração final é de 5-10%, misturar bem e colocar à temperatura ambiente para uso posterior.
(3) De acordo com a operação de subcultura de células, colete as células cultivadas e tome uma pequena quantidade de suspensão de células (cerca de 0,1 ml) para contar a concentração de células e a taxa de sobrevivência antes do congelamento.
(4) Centrifugue, remova o sobrenadante, adicione uma quantidade apropriada de solução de criopreservação para fazer a concentração de células 1-5 x 106 células/ml, misture bem e dispense no tubo de criopreservação rotulado, 1 ml/frasco, e pegue um pequeno quantidade de suspensão de células para detecção de contaminação.
(5) Método de criopreservação 1: O criotubo é colocado a 4 oC por 10 minutos → -20 oC por 30 minutos → -80 oC por 16 a 18 horas (ou durante a noite) → fase de vapor do tanque de nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
(6) Método de armazenamento por congelamento 2: O tubo de congelamento é colocado em uma máquina de resfriamento de velocidade constante com um programa definido e, em seguida, colocado em um tanque de nitrogênio líquido.
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