Summary: Depois que um laboratório obtém uma nova linha celular, a linha celular deve primeiro ser cultivada e expandida e depois congelada. A criopreservação de células pode ser usada em primeiro lugar como backup quando as células são perdidas ......
Depois que um laboratório obtém uma nova linha celular, a linha celular deve primeiro ser cultivada e expandida e depois congelada. A criopreservação de células pode ser usada em primeiro lugar como backup quando as células são perdidas devido à poluição e outras condições. Além disso, quase todas as células sofrem um certo grau de variação durante o processo de cultura e passagem. Para manter a consistência dos resultados experimentais, geralmente as células não podem ser cultivadas por dezenas de gerações. Se for usado novamente, é necessário descongelar e cultivar as células criopreservadas e menos passadas antes do uso.
Existem quatro pontos principais no processo de congelamento de células: colheita de células, uso de agentes protetores, taxa de congelamento e ambiente de armazenamento.
Colheita de células
As células usadas para criopreservação são geralmente selecionadas quando as células são aproximadamente 90% confluentes. Neste momento, o crescimento celular é bom e o número de células é grande, e o meio de cultura deve ser trocado 24 horas antes da colheita das células. O método de colheita das células para criopreservação é o mesmo de sempre. Centrifugar a 100xg por 5 minutos para coletar as células e ressuspender. As células vivas são contadas. Diluir ou concentrar para duas vezes a concentração celular final para preservação celular (geralmente 4-10 milhões de células/ml), adicionar um volume igual da solução de mistura de agente protetor do meio de cultura que foi preparada e misturar suavemente e alíquotar no tubo de criopreservação, criopreservação.
Uso de agentes protetores.
Na criopreservação de células, o DMSO é geralmente usado como agente protetor. Na criopreservação de células, a concentração final de DMSO utilizada é geralmente de 5-15%. A concentração de DMSO na solução de criopreservação de uma célula específica pode ser encontrada em ATCC. Para células particularmente sensíveis, especialmente células de hibridoma, pode ser melhor usar 95% de soro e 5% de DMSO ao criopreservar. Ao usar o agente protetor, use meio de cultura ou soro para fazer o dobro da concentração final e, em seguida, misture com um volume igual de meio de cultura celular em suspensão. Taxa de congelamento celular
A taxa de congelamento das células é melhor controlada para permitir tempo suficiente para que as células sejam desidratadas sem serem danificadas por desidratação excessiva. Para a maioria das células, uma queda de temperatura de 1 a 3°C por minuto é apropriada. A operação usual é colocar as células a -20°C por 1-2 horas, depois colocá-las na geladeira a -80°C durante a noite (se não houver geladeira a -80°C, você pode usar gelo seco) e em seguida, transfira para o tanque de nitrogênio líquido ou abaixo de -130 Armazenamento a longo prazo na geladeira a ℃.
Ambiente de armazenamento
A temperatura de armazenamento a longo prazo das células é de -130 ℃ ou inferior. A temperatura da camada gasosa no tanque de nitrogênio líquido está entre -140℃ e -180℃. As células podem ser armazenadas na camada gasosa ou imersas em nitrogênio líquido. Se possível, é melhor armazenar na camada gasosa, pois isso pode evitar que o nitrogênio líquido entre no armazenamento de congelamento. O tubo provoca uma explosão quando as células são retiradas (mas desta forma, apenas uma pequena quantidade de nitrogênio líquido pode ser armazenada no tanque de nitrogênio líquido, que precisa ser adicionado com frequência). As células também podem ser armazenadas na geladeira a -80 ℃ por alguns meses ou mais.
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